苯基疏水色譜柱是一種基于苯基基團修飾的填料實現(xiàn)樣品分離的色譜柱，廣泛應用于生物大分子（如蛋白質(zhì)、多肽）及芳香族化合物的分離分析。其核心原理在于苯基基團通過化學鍵合固定在硅膠或其他基質(zhì)上，形成穩(wěn)定的疏水層，利用疏水作用及π-π電子相互作用實現(xiàn)分離。

　　其分離效果依賴于鹽濃度調(diào)控。高鹽環(huán)境下，樣品疏水區(qū)域暴露，與填料結(jié)合緊密；鹽濃度降低時，疏水作用減弱，樣品逐漸洗脫。此外，苯環(huán)與芳香族化合物之間可形成π-π相互作用，為含芳香環(huán)的化合物提供獨t的選擇性，尤其適用于分析帶有吸電子基團的芳香化合物。

　　苯基疏水色譜柱的操作需結(jié)合其固定相特性（苯基基團的疏水作用與π-π相互作用）和反相色譜的通用規(guī)則，以避免柱效下降、保留行為異常或損壞色譜柱。以下是關(guān)鍵操作事項：

　　一、柱前準備與安裝

　　色譜柱檢查

　　確認柱子型號與規(guī)格：核對柱長、內(nèi)徑、粒徑（如4.6×250mm，5μm）及耐受條件（pH范圍通常為2-8，部分寬pH柱可達1-10），避免超出范圍使用導致固定相水解或硅膠基質(zhì)溶解。

　　新柱活化：s次使用前，用純甲醇或乙腈低流速（0.2-0.5mL/min）沖洗30-60分鐘，去除柱內(nèi)保存液（通常為甲醇或乙腈-水混合液），平衡固定相。

　　系統(tǒng)兼容性檢查

　　確保儀器管路、進樣閥、檢測器流通池無殘留污染物（如鹽、強極性物質(zhì)），避免污染色譜柱。若之前使用過離子對試劑或緩沖鹽，需用純水徹d沖洗系統(tǒng)后再連接苯基柱。

　　連接方向：按柱上箭頭指示（從進樣端到檢測端）安裝，避免反接導致固定相流失或柱效下降（部分品牌柱子可反沖，需參考說明書）。

　　二、流動相配制與使用

　　流動相選擇原則

　　溶劑兼容性：常用流動相為水-甲醇、水-乙腈混合液，避免使用與固定相反應的溶劑（如四氫呋喃需謹慎，高比例可能破壞苯基鍵合）。

　　避免強極性離子對試劑：如十二烷基硫酸鈉（SDS），其疏水鏈易與苯基強結(jié)合，難以沖洗，導致柱效不可逆下降。若需使用，事后需用純有機溶劑長時間沖洗。

　　緩沖鹽使用：若樣品需調(diào)節(jié)pH，選用揮發(fā)性緩沖鹽（如磷酸二氫鉀、甲酸銨），濃度不超過50mmol/L，避免鹽析出（需用0.22μm濾膜過濾并超聲脫氣）。

　　流動相切換注意事項

　　梯度洗脫時，有機相比例變化需緩慢（如每分鐘變化不超過10%），避免因溶劑極性突變導致固定相膨脹/收縮，產(chǎn)生氣泡或柱壓波動。

　　從高水相切換到高有機相時，需先過渡（如50%甲醇），防止鹽在低水相中析出堵塞色譜柱。

　　三、樣品處理與進樣

　　樣品預處理

　　去除顆粒物：樣品需經(jīng)0.22μm濾膜過濾（水性樣品用水系濾膜，有機樣品用有機系濾膜），避免堵塞色譜柱入口。

　　基質(zhì)匹配：樣品溶劑極性應與流動相初始比例接近，若樣品含高比例有機溶劑（如純甲醇），進樣前需稀釋，否則可能導致峰展寬或保留時間漂移。

　　避免強保留物質(zhì)：若樣品含大量芳香族雜質(zhì)（如多環(huán)芳烴），需預處理去除（如固相萃取），防止其吸附在苯基固定相上難以洗脫，污染柱子。

　　進樣操作

　　進樣體積：根據(jù)柱內(nèi)徑選擇合適體積（4.6mm內(nèi)徑柱通常≤20μL），過大可能導致柱超載，峰形拖尾。

　　進樣前排氣泡：確保進樣針和定量環(huán)內(nèi)無氣泡，避免氣泡進入柱子造成柱效下降。

　　四、色譜條件設置

　　流速與柱壓

　　流速：根據(jù)柱內(nèi)徑設定（4.6mm內(nèi)徑柱常用1.0mL/min），避免超過儀器或柱子的最大耐受壓力（通常≤40MPa），高壓可能導致固定相顆粒破碎。

　　柱壓異常：若柱壓突然升高，可能是柱子堵塞，需立即停泵，用低流速純水或5%甲醇沖洗，不可強行高壓沖洗。

　　柱溫

　　控制柱溫（常用30-40℃），溫度波動會影響保留時間穩(wěn)定性（尤其對芳香族化合物的π-π作用影響顯著）。

　　避免驟冷驟熱：柱溫箱升溫/降溫速率不宜過快（≤5℃/min），防止柱子因熱脹冷縮受損。

　　五、洗脫與柱后維護

　　洗脫操作

　　目標物洗脫：對于強保留的芳香族化合物，可提高有機相比例（如乙腈比例至80%-100%），或適當延長洗脫時間，確保完q洗脫，避免殘留污染。

　　避免過度洗脫：純有機溶劑（如100%乙腈）長時間沖洗可能導致苯基固定相流失，建議洗脫后用50%有機相過渡。

　　日常維護

　　實驗結(jié)束后沖洗：先用10%-20%甲醇/乙腈水溶液沖洗30分鐘（去除殘留鹽和極性物質(zhì)），再用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘（保護固定相，防止微生物滋生）。

　　長期存放：柱子需充滿純甲醇或乙腈（密封兩端），置于室溫干燥處，避免陽光直射（防止硅膠基質(zhì)老化）。

　　污染處理

　　輕度污染：用50%甲醇-水沖洗1-2小時，或用含5%-10%異丙醇的甲醇溶液沖洗（異丙醇可增強對疏水污染物的洗脫）。

　　嚴重污染：若上述方法無效，可嘗試反沖（需確認柱子支持反沖），低流速（0.3mL/min）用純乙腈沖洗，但可能導致柱效不可逆損失，需謹慎。