丁基疏水色譜柱是一款以丁基鍵合無孔型親水性聚合物基質為填充劑的疏水作用色譜柱。其填料材料通常采用具有丁烷基疏水性質的有機硅，這種材料既具有良好的化學穩定性，又能有效地保持化合物分子的親疏水平衡。此外，也有以粒徑為2.5微米的丁基鍵合無孔型親水性聚合物基質為填充劑的疏水色譜柱，如TSKgel Butyl-NPR色譜柱。
丁基疏水色譜柱的分離機理與反相色譜基本相同，都是利用溶質與固定相間的疏水相互作用實現分離。不同的是，其固定相的疏水性不如反相固定相強，多為低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。在高濃度鹽溶液中，親水性較強的物質分子內部的疏水基團外露，可與疏水的固定相以疏水作用力相結合（吸附）。由于這種作用力大小不同，可以通過改變極性流動相的離子強度（由高到低）使其依次解吸附，從而實現分離。
1、樣品預處理
去除雜質：在使用之前，需要對樣品進行適當的預處理，去除其中的雜質。雜質可能會干擾分離過程，導致峰形拖尾或分離效果不佳。可以使用過濾、離心等方法去除樣品中的顆粒物和沉淀，也可以使用萃取、吸附等方法去除樣品中的雜質分子。
調整pH值：樣品的pH值對丁基疏水色譜柱的分離效果有重要影響。一般來說，在中性或弱酸性的條件下，丁基疏水柱能夠更好地保持其親疏水平衡，從而實現更高效的分離。因此，在進樣前，需要根據樣品的性質和分離要求，選擇合適的緩沖液來調整樣品的pH值。
調整離子強度：離子強度也會影響樣品與色譜柱填料之間的疏水相互作用。適當降低樣品的離子強度，可以增強疏水相互作用，提高分離效果。可以通過稀釋樣品、使用低濃度的緩沖液等方法來調整樣品的離子強度。
2、色譜柱的選擇與連接
選擇合適規格：根據樣品的復雜程度、分析目的和實驗室條件等因素，選擇合適的色譜柱。例如，對于復雜樣品的分離，可以選擇較長、內徑較小的色譜柱；對于快速分析，可以選擇較短、內徑較大的色譜柱。
正確連接色譜柱：將色譜柱入口端連接到系統上，柱出口端先不要連接，色譜柱身上有箭頭標明正確流向。當溶劑均勻地從柱出口端流出時，再將色譜柱出口端接到系統檢測器上，這樣可以避免氣泡進入檢測系統，并且可快速達到基線平衡。
3、流動相的選擇與優化
選擇合適的有機溶劑：通常使用含有有機溶劑（如乙腈、異丙醇）的緩沖液作為流動相，以促進生物大分子與色譜柱填料的疏水相互作用。不同的有機溶劑對分離效果有不同的影響，需要根據樣品的性質和分離要求選擇合適的有機溶劑及其比例。
控制流動相的pH值：流動相的pH值會影響樣品和色譜柱填料的電荷狀態，從而影響疏水相互作用。在選擇流動相的pH值時，需要考慮樣品的穩定性和溶解性，以及色譜柱的適用范圍。
優化流動相的組成：通過調整流動相中不同組分的比例，可以優化分離效果。例如，增加有機溶劑的比例可以增強疏水相互作用，但過高的比例可能會導致樣品在色譜柱上的保留時間過長；增加緩沖鹽的濃度可以調節樣品的電荷狀態，但過高的濃度可能會導致鹽析現象。
4、流速和壓力的控制
控制流速：在使用色譜柱時，需要注意控制流速。過高的流速可能會導致柱子破裂或分離效果不佳，而過低的流速則會延長分析時間。一般來說，可以根據色譜柱的內徑和長度，以及樣品的復雜程度等因素，選擇合適的流速。
監測壓力：在分離過程中，需要實時監測色譜柱的壓力。如果壓力過高，可能是由于流速過快、樣品過載或色譜柱堵塞等原因引起的。此時需要及時調整操作參數，降低壓力，以避免對色譜柱造成損壞。
5、分離條件的優化
梯度洗脫：對于復雜的樣品，可以采用梯度洗脫的方法來提高分離效果。梯度洗脫是指在分離過程中，逐漸改變流動相的組成或pH值，使不同的組分在不同的時間被洗脫出來。通過優化梯度洗脫的程序，可以實現更好的分離效果。
溫度控制：溫度對疏水相互作用有一定的影響。適當提高溫度可以增強疏水相互作用，但過高的溫度可能會導致樣品變性或色譜柱的性能下降。因此，在進行丁基疏水色譜分析時，可以根據需要選擇合適的溫度。
6、色譜柱的維護與保養
定期清洗：使用新鮮潔凈的水與乙腈沖洗系統，確保系統干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。每次使用完色譜柱后，應及時用純水或適當的溶劑清洗色譜柱，去除殘留的樣品和雜質。
避免碰撞：取用色譜柱時避免磕碰掉落，以免損壞色譜柱的填料和結構。
長期保存：如果長時間不使用色譜柱，應將其保存在合適的條件下，避免污染和損壞。可以將色譜柱保存在純水或適當的溶劑中，并放置在陰涼、干燥的地方。
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